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生命体的各种功能、活动涉及一系列基于分子的复杂系统的相互协调.因此,随着生物学的研究从对单一生命现象的解析及其调控深入到探究背后的复杂分子机制及调控后的潜在影响,旨在对影响一个或多个生物体结构、功能和动力学变化的大量生物分子库进行表征和量化的组学(Omics)技术受到越来越广泛的关注.20世纪90年代早期,Hood等人利用自动DNA测序仪和喷墨DNA合成仪进行全局基因表达,即转录组学分析,这也被认为是第一项组学研究.随着研究对象的多样化,蛋白质组学、代谢组学、基因组学、表观基因组学、脂质组学、糖组学等研究逐渐出现.近期,人体疾病,特别是恶性疾病(如肿瘤等)广泛存在的异质性,对疾病检测、分型、预后和最佳治疗方案提出了巨大挑战.随着高通量多组学联合分析、新型的环境暴露组学以及基于质谱成像的空间组学技术的提出和发展,它们被用于提供相关疾病的详细特征、寻找疾病检测的早期生物靶标及预测疾病病程的标志分子.

目前,组学研究主要基于大规模并行测序技术和色谱(气相色谱、液相色谱等)或电泳技术结合的质谱技术,在传统的基因组学、蛋白质组学分析之外,这两种技术甚至可实现对体细胞结构变异的功能分析和膜蛋白的内源性配体的鉴定.然而,随着对疾病的研究进入单细胞水平,单细胞的异质性、单细胞的低样本量、对疾病特征起关键作用的低丰度代谢物、稀有突变等对现有的组学分析技术,主要是对质谱技术提出了新的挑战.其中,基于测序与质谱技术的单细胞空间组学以及单细胞代谢组学分别在2022年和2023年被Nature评为最值得关注的年度7项技术之一.质谱方法通过对样品的前处理过程,包括标记、富集、采样、分离等进行优化和多技术耦合,从而针对性地克服检测中的低样本量、分子丰度差异大等挑战,然而这些操作不可避免地增加了组学分析的操作复杂性及时间损耗,降低检测通量.更重要的是,生物分子广泛存在异质性,包括辅酶分子的构象异质性、蛋白质结构异质性、蛋白质翻译后修饰的异质性等.这些单分子的异质性与分子的功能密切相关,如辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸的“张开”与“堆叠”构象与其在黄素蛋白中起到的电化学活性与光化学活性相关,而组蛋白上翻译后修饰的类型与位点差异更是决定了其对基因表达的调

控.单分子异质性以及生物分子,如代谢物、激素等分子的时序动态性,进一步要求检测方法避免大量分子平均信息的干扰、确保检测的高效性,因此亟需一种单分子的时序动态组学研究方法.

近年来,纳米孔道作为高通量的单分子技术发展迅速,其机理是利用单个目标分子在多种电驱动力或压力差的作用下穿过纳米孔道内部的纳米限域空间时产生特征离子流信号,从而研究生物分子的特征.与单分子力谱(原子力显微镜(AFM)、光镊、磁镊等)长时间分析单个分子或单分子荧光通

常需要对目标分子进行荧光标记等不同,纳米孔道单分子技术可以在无标记或无修饰的状态下逐个、高效读取单个分子的特征信息,包括分子尺寸、电荷、构象、相互作用等.因此,纳米孔道技术同时具备从单分子水平、高通量读取体系内各类分子特征的优势,有望成为一种单分子组学方法,赋予组学分析一个全新的解析层面,同现有的组学方法结合以获取对复杂体系更为细致且全面的理解.

01

单分子质谱

质谱技术以其同时鉴定大量分子的特征在目前组学分析中起到至关重要的作用,从代谢组学、糖组学到脂质组学,甚至成为目前更高维度的空间组学中不可或缺的部分,而纳米孔道单分子技术可以被认为是一定程度上的“单分子质谱”.2007年,Kasianowicz首先提出基于纳米孔道的“单分子质谱”分析的概念,其利用α-溶血素(α-Hemolysin,α-HL)实现了溶液中聚合度为25~50的聚乙二醇(PEG)的高通量分析,如图1(a)所示.纳米孔道获得的单分子层面的多分散PEG的阻断程度统计分布与传统的基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF)获取的质量分布图具有很好的吻合性,证实了将纳米孔道用于单分子层面的聚合物质量分析的可行性.随后,通过优化实验条件、构建嵌合体等策略,实现了单个聚合度差异的PEG分子的高分辨鉴定(图1(b)),同时拓展了PEG聚合度检测范围(图1(c)).

2016年,基于高度限域、且内腔化学环境多样的气单胞菌溶素(Aerolysin, AeL),纳米孔道“单分子质谱”的范围被首次拓展到PEG分子之外,研究人员实现了对单个核酸聚合度差异的DNA的高分辨识别(图1(d)).更重要的是,在具有极高分离度(>2)的同时,由于逐个读取单个分子的检测特性排除了大量分子平均信息的干扰,纳米孔道检测具有比质谱更高的灵敏性,可以检测到质谱分析中无法测到高效液相色谱分离后高聚合度DNA样品中残余的低丰度、低聚合度DNA分子.随后,进一步将AeL拓展到单个聚合度差异的多肽分析,分辨了混合体系中5~10个氨基酸长度范围内的均聚精氨酸多肽(图1(e)).因此,与质谱技术类似,纳米孔道技术以分子质量分析的能力可用于组学分析,而基于纳米孔道的“单分子组学”有望提升组学分析对体系内分子,特别是低丰度分子的覆盖度,有助于新型疾病标志物的发现与鉴定.

图1 纳米孔道“单分子质谱”.(a)纳米孔道作为质谱从单分子水平检测不同聚合度的PEG分子;(b)优化的实验体系提高纳米孔道单分子质谱的分辨率;(c)利用DNA发夹结构分辨低聚合度的PEG分子;(d)纳米孔道作为单分子质谱实现单个聚合度差异的DNA的识别;(e)纳米孔道作为单分子质谱实现单个聚合度差异的均聚精氨酸多肽的识别

02

“质量”之外的单分子特征提取

细胞内的酶催化反应等生物过程，通常在单分子层面逐个进行,因此,解析细胞内同种分子在单分子层面的异质性,包括结构/构象异质性、修饰位置/类型异质性、酶催化特征异质性等至关重要.随着组学分析的深入,在对不同种类的分子进行定性及定量的同时,也需要鉴定同种分子的不同状态.与质谱技术的信号单纯来源于分子的质荷比不同,纳米孔道获取的单分子的电信号不只取决于传统上认为的分子质量/体积,现有的实验证实其还与分子的电荷、构象等相关,甚至分子和孔道之间的相互作用对电流信号的贡献可以比分子体积更大.因此,纳米孔道能从单分子层面读取分子在“质量”之外的差异.以对映异构体为例,

2006年,基于α-HL嵌合环糊精,研究人员实现了对药物布洛芬和沙利度胺分子的R、S构象的逐个检测(图2(a)),有助于对药物的对映异构体在镇静、致畸、抗肿瘤等的作用解析.类似地,在AeL纳米孔道上实现了对光异构的偶氮苯分子的R、S构象的识别(图2(b)).在非共价构象变化方面,利用AeL获取了对辅酶黄素-腺嘌呤二核苷酸(FAD)的“张开”与“堆叠”的状态,并鉴定了其在特定环境中的四种“准堆叠”构象(图2(c)),其可能与FAD在不同蛋白中的光化学活性和电化学活性相关.在修饰位点方面,纳米孔道技术可以实现对DNA上磷酸化位点的识别,以及多肽上翻译后修饰,如磷酸化、乙酰化位置的检测(图2(d)).因此,纳米孔道单分子技术有望在组学分析中提供单分子异质性的信息,结合其他组学方法,提升组学数据的信息维度.

图2 基于纳米孔道的单分子异质性解析.(a)α-HL纳米孔道嵌合β-环糊精用以识别布洛芬的手性差异;(b)AeL纳米孔道直接读取光致异构的偶氮苯构象;(c)AeL纳米孔道解析FAD分子的单分子构象异质性;(d)AeL纳米孔道识别Tau蛋白片段磷酸化修饰异质性

03

时间组学

随着对解析人体组织、肿瘤内异质性的重要性逐步提升,“空间组学”这一全新维度的多组学分析技术应运而生,旨在通过以细胞和亚细胞分辨率对组织进行原位组学研究,以理解组织、肿瘤微环境中位置相关的细胞异质性.相应地,考虑到生命体中代谢物、激素等小分子高度的时间动态性,其半衰期甚至小于分钟级,发展绘制体系内大量分子实时变化图谱的“时间组学”也将是组学分析的必经之路.尽管质谱等组学方法可以通过低时间间隔地连续采样来实现对分子变化的高时间覆盖,然而频繁采样必将对样品量提出更大的需求,这与现有单细胞分析的低样本量相斥.更为重要的是,在质谱前处理时对样本中正在进行的识别、反应过程的中止,以及检测时对生物分子结构功能的破坏将不可避免地引入对代谢中间物结合、释放的检测误差,从而进一步影响对整个检测体系时序变化的理解.纳米孔道技术作为一种非破坏性技术,以其高通量读取单个分子有望成为“时间组学”的重要组成部分,其基本原理在于:基于对通过纳米孔道内离子流的连续记录,高通量地获取不同时间点被捕获的单个分子组成、结构等信息,结合给定时间段内不同种类分子的捕获率随时间变化及分子间的捕获率差异,从而在单分子层面阐明体系内分子种类、浓度、结合/释放状态等随时间变化的图谱.

目前,基于纳米孔道对DNA聚合度的高空间分辨和高效解析,研究人员实时监测了核酸外切酶I(Exo I)对DNA的“步步剪切”过程.如图3(a)所示,在不同的时间段内,可以监测到体系内DNA聚合度的逐步变化过程.类似地,通过对不同时间段内底物与产物的动态监测,纳米孔道技术实现了对胰蛋白酶降解聚精氨酸链、T3-DNA连接酶修复双链DNA断裂以及尿嘧啶-DNA糖基酶修复DNA损伤过程的研究.近期,研究人员进一步将纳米孔道单分子技术用于研究肾素-血管紧张素系统(RAS)中的串扰效应.基于工程化Aerolysin纳米孔道对系列血管紧张素的高效、高分辨读取,结合优化的多肽定量方法,能绘制出在两种血管紧张素转化酶(ACE、ACE2)介导下血管紧张素I(AngI)短至分钟级的演化路径(图3(b)),证实了ACE和ACE2之间的串扰效应.未来,基于阵列芯片,纳米孔道对于分子的定量间隔可以进一步缩短,理论上可以达到单个分子通过纳米孔道所需的时间尺度,这里为毫秒级.因此,基于纳米孔道单分子技术,有望构建“时间组学”,结合目前的“空间组学”,将为理解、调控生命过程和干预疾病发生发展等提供一幅时空演化谱图.

综上,纳米孔道技术以其能高效、逐个鉴定单个分子的特征,为组学研究提供了一种潜在的方法.除了高分辨地通过质量差异同时读取多种分子之外,纳米孔道可以额外提供分子异质性的信息,结合其对低丰度分子检测的高敏感性,可同时提高组学分析的覆盖广度和深度.更重要的是,基于检测的无标记、非破坏性、高效性,纳米孔道检测为“单分子时间组学”的构建提供了可能.然而,基于纳米孔道的单分子时间组学研究需要克服以下挑战:(1)由于分子所对应的离子流阻断程度的影响因素众多,针对组学水平分子库的识别,需要提高纳米孔道电流的特异性,可通过增加数据处理方法的分析维度以应对这一挑战;(2)由于生物分子的电荷多样性,需要突破目前以电泳力为主的纳米孔道捕获方法,发展电泳力等通用型的纳米孔道分子协同捕获策略;(3)由于组学水平分子库中分子的多样性、单分子异质性以及修饰多样性,需要提升纳米孔道的检测范围及空间分辨率,如针对性地构建用于不同类型生物分子,包括核酸、多肽、糖的高灵敏性纳米孔道;(4)由于时间组学对获取体系中生物分子动态变化的要求,需要提升纳米孔道的检测通量,例如构建多通道并行检测的纳米孔道阵列.未来,纳米孔道单分子时间组学有望在分钟级、秒级甚至是毫秒级绘制生物活性分子演化谱图,为理解生命中复杂的分子相互作用及影响机制,寻找、检测更具特征的疾病标志物,理解、判断疾病病程等提供指导.

图3 基于纳米孔道的时序动态解析.(a)AeL纳米孔道实时监测Exo I对DNA的“步步剪切”过程;(b)AeL纳米孔道解析RAS系统中ACE和ACE2之间的串扰效应

原文信息

李孟寅, 蒋杰, 牛红艳, 应佚伦, 龙亿涛. 基于纳米孔道的单分子时间组学. 科学通报, 2023, 68(17): 2148–2154

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