湖南大学法硕录取分析2023，为什么湖南大学法硕分数线那么低

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湖南大学法硕，湖南大学法硕分数线2022

可应用于生命系统的金属催化体系具有巨大的潜力，它能扩大生物正交化学的适用范围，有望实现在活体、活细胞内的特定位置构建目标分子的目的，从而实现高效前药转化及药物的主动靶向摄取。然而，在生命系统中实现金属非天然催化也面临着很大的挑战，包括催化剂的生物相容性问题、低底物浓度问题、复杂环境引起的金属稳定性问题，以及各种生物屏障对催化剂递送的影响问题等。为解决这些问题，目前已有的策略包括（1）构建具有类似于酶空腔结构的大分子骨架来促进金属位点与外部环境的隔离以及底物的富集；（2）将金属催化剂放置在更“清洁”的微环境中来提高其稳定性。这些策略为金属催化剂在生命系统的应用提供了更多可能性。

近日，湖南大学白玉罡教授课题组报道了一种基于阳离子致密壳纳米粒子（DSNP）骨架的嵌膜大分子催化剂（Membrane-embedded catalyst, MEC），该类催化剂有效结合了上述两点策略，在活细胞体系中工作时仍然可以显示出底物选择性和优异的催化效果。作者首先进行了DSNP的构效关系研究，证明了DSNP具有良好的膜亲和力，亲和力受电荷密度、电荷类型和颗粒大小等因素的影响，其中表现最好的季鏻盐DSNP可作为MEC介导高效的膜上催化过程，并保持对亲脂性和阴离子底物的选择性。这种MEC的设计为多功能生物正交催化剂提供了新途径，为前药设计和靶向递送系统给出了新的解决方案。相关成果以“A Membrane-Embedded Macromolecular Catalyst with Substrate Selectivity in Live Cells”为题，发表于在 Journal of the American Chemical Society杂志上并被选为封面文章，湖南大学化学化工学院硕士研究生邓颖姣和博士生吴彤为论文的第一作者。

【文章要点】

图1：基于DSNP的嵌膜催化剂的合成、影响MEC性能的参数，以及调整参数进行结构-性能研究和性能优化的方法

在本项目中，申请人首先采用了自下而上的合成策略，构建了具有不同结构参数的DSNP骨架，这些参数包括尺寸、电荷密度和带电部分的类型，从而得以进行详细的结构-性质关系研究。如图1，作者使用了三种降冰片烯衍生物单体（M Br、M OEG和M FL）和一种三唑交联剂（NB 3-TTA）经由开环易位聚合-交联过程合成了具有不同端基溴修饰密度（决定电荷密度）和分子量的DSNPs，随后的三乙基膦（PEt 3）、N,N-二甲基丁胺（NMe 2Bu）、正丁基咪唑（ImBu）的官能化过程决定了NPs上带电基团的类型。在DSNP的结构-性质关系研究（图2）中，流式细胞仪、激光共聚焦显微分析的结果显示： IDSNP S-2/3和 PDSNP S-2/3相比 NDSNP S-2/3有更好的膜定位效果；随着电荷密度的增加，不同电荷类型的DSNP的膜靶向效率差异逐渐降低；电荷种类相同时，电荷密度增高，膜嵌入效率增加；DSNPs进入细胞内部的能力随着尺寸的增加而增加，同时膜结合效率降低，但这种穿膜的负面效果可以通过用OEGs取代带电部分来降低电荷密度来缓解。

图2：(a) NIH/3T3细胞与荧光标记的具有不同电荷密度和电荷结构的小尺寸DSNPs孵育后的共聚焦图像。(b) NIH/3T3细胞与不同大小的、具荧光标记的IDSNPs孵育后的共聚焦图像以及使用的相应IDSNP的AFM图像。(c) NIH/3T3细胞与具荧光标记的、不同电荷密度的大尺寸DSNPs孵育后的共聚焦图像。(d) 流式细胞术定量0.5 h孵育后各种DSNPs （5 nM）的细胞摄取总量，包括嵌入NIH/3T3细胞上或内化到NIH/3T3细胞中的DSNPs。

根据上述结构-性质关系研究的所有结果，作者选择了小尺寸、低电荷密度的 XDSNP S-2/3进行荧光CuAAC模型反应评估它们的催化效率（图3a/b），该催化体系动力学特征表现出S型转化率-时间曲线，表明催化应该发生在DSNP内部；且阳离子结构在一定程度上影响催化效率，排序为 PDSNP S‑2/3 > NDSNP M‑2/3 > IDSNP L‑2/3。根据膜定位和催化效率， PDSNP S‑2/3被选为最佳的MEC候选结构，因此作者进一步对其进行了底物选择性验证。结果表明，该DSNP介导的催化过程的k acc’取决于底物上的电荷态和烷基链的长度，对疏水性和阴离子底物表现出更高的催化效率（图3e）。十二烷基硫酸钠(SDS)对 PDSNP S-2/3在1-4c之间的催化能力表现出浓度依赖性抑制，可能是由于其与DSNPs中的疏水腔竞争性结合。最重要的是，共聚焦显微分析和流式细胞仪分析结果表明，当DSNP包埋在活细胞细胞膜上时，其底物选择性仍可保留（图3g/h）。

图3 ：(a) 用于监测Cu-DSNP介导的非生物催化的荧光反应示意图。(b) 阳离子结构对DSNP的 CuAAC催化效率的影响。(c) 在不同介质中MEC的膜定位及催化效果展示。(d) 本工作中底物选择性研究所用到的所有底物的结构。(e) 荧光底物1和炔基底物2a-4c之间的反应计算的加速阶段反应速率常数（kacc’）的比较。(f) PDSNPS-2/3催化中SDS对4c和1之间反应的浓度依赖性抑制作用展示。(g) PDSNPS-2/3在NIH/3T3细胞膜上的催化效率随着底物对催化剂的亲和力增加而增加（2a为阳离子，3a为中性，4a为阴离子）。(h) 1与底物2a-4c的反应性比较，由流式细胞术分析检测到的荧光强度表示。

利用 PDSNP S‑2/3这种“膜嵌入”式催化剂可实现功能分子的按需合成与跨膜递送。例如，许多药物必须首先能够进入细胞才可发挥作用，而由于DSNP“在膜中工作”的性质，它有望通过胞外底物的原位连接来解决一些药物分子难以进胞的问题（图4a）。为了进行直接评估，作者选择了富含酚羟基的香豆素衍生物7作为模型化合物（图4b）。选择化合物7是因为其具有高极性和形成氢键的倾向，从而具有低的膜渗透性。由于底物6的阴离子性质，使其与5的反应更有效，高效合成产物分子7，它可在合成后经由DSNP骨架直接扩散到细胞内（图4c，d）。在另一模型实验中，作者选择了细胞凋亡剂TA-Rsv（一种已报道的白藜芦醇类似物）作为模型系统（图5e）。单独的两种底物和MEC都没有毒性，但是当Cu I-DSNP MEC存在于细胞膜上时，两种底物反应生成TA-Rsv从而诱导细胞凋亡（图4f）。值得注意的是，与相同浓度（20 μ M）的纯TA-Rsv处理相比，该膜催化组合显示出更显著的凋亡效果，表明膜上合成策略在很大程度上避开了TA-Rsv的膜渗透性问题。

图4：(a) DSNP-MEC介导的膜上合成与递送过程示意图。(b) 底物5和6反应生成不易进入细胞的荧光团7的示意图。(c) HeLa细胞对膜上生成和直接递送的产物7的摄取效果的区别，由共聚焦显微镜成像展示。(d) 流式细胞术研究表明PDSNPS2/3-MECs通过膜催化方法成功增强了产物7的细胞摄取，与共聚焦成像的研究结果一致。(e) 底物6和8反应生成细胞凋亡剂TA-Rsv的过程示意图。(f) 基于MEC的TA-Rsv膜上合成策略对该化合物抗癌效果的提升示意图。

图5：9、Pro-9和Pro-9-SO3-的结构和细胞毒性。(b)化合物9~11的细胞毒性比较和Pd-DSNP介导的前药激活后的活性比较。

药物衍生化是提高药物疗效和治疗指标的有效手段。例如，喜树碱类似物9（SN-38，图5a）是一种已知的抗癌分子，但水溶性过低难以应用。商业化的Irinotecan是9的衍生物，其正电荷修饰保证了一定的水溶性，该修饰可被癌细胞内的酶去除从而激活药物活性，从而同时达到提高水溶性和降低副作用的效果。在过往报道中，研究者还合成了毒性较低的9的衍生物Pro-9，它可被癌细胞内Pd催化剂转化为9来激活其细胞毒性（图6a），这样也达到降低对正常细胞的毒性的目的。然而，Pro-9仍可能渗透到正常细胞中，因此其对于非癌细胞的细胞毒性仍然不可忽视，并且该修饰的疏水性更强，这都可能导致体内给药的限制。作者推测基于阴离子选择性DSNP的MEC系统可以为上述问题提供一种新的解决方案，并合成了Pro-9-SO 3 -（图6a）来测试该策略的可行性。实验结果表明，Pro-9-SO 3 -水溶性好，并且细胞毒性远低于9和Pro-9（图6b），因为其阴离子永久电荷降低了它进入细胞的能力。并且，与Pro-9一样，Pro-9-SO 3 -可以被Pd- PDSNP S‑2/3转化为活性化合物9，由此便降低了分子的脱靶毒性。由于药物的阳离子化修饰在带来水溶性和进胞能力的同时会带来膜破坏能力、毒性、非特异性吸附，因此将阴离子修饰的药物与合适的生物正交催化剂结合使用可能会给药物开发带来新的灵感和解决方案。

图6：(a) BRD4抑制剂和AMPK激活剂反应生成细胞自噬剂的反应示意图。(b)共聚焦显微镜下的细胞自噬标记蛋白LC3的可视化展示，膜催化组展现出最好的自噬诱导效果。(c) LC3B标记蛋白的定量分析结果同样表明MEC膜催化组有着最好的自噬诱导效果。(d)共聚焦显微成像显示10和11经由膜催化过程生成12时可以展现出比纯化合物12更强的诱导的线粒体膜电位降低的效果。(e) 细胞活力测定结果表明，MEC、10和11（10或5 μM, 4 h）组成的膜催化体系可以带来更好的自噬诱导活性，较直接使用同浓度纯品12的效果更佳。

在对阴离子前药设计进行研究之后，作者转向了更具挑战性的方案：大阴离子底物在细胞膜上的双分子反应，以验证这种“结合-催化”工作方式的优势。通过催化剂的选择性底物结合可以增加底物的局部浓度，提高低底物浓度下的催化转化效果。作者尝试了如图7a所示的反应。如图7 b、c所示，在用纯12或10 + 11处理时，细胞均显示了较低的LC3B（作为自噬体指示物的经典标记蛋白）的表达水平。然而，当10和11经由膜催化过程原位生成12时，LC3B表达增加是显著的。这些结果表明，Cu- PDSNP S‑2/3在活细胞体系环境中成功地介导了该双分子反应，并且DSN在此催化过程同时提升了产物进入细胞的能力。为了更好地证明是在膜上合成的化合物12而不是催化过程本身导致了自噬，作者还使用JC-1（一种膜电位敏感染料）对10、11和Cu- PDSNP S‑2/3处理的细胞进行了染色。结果表明，这种处理会导致JC-1的红色荧光随时间降低，表明线粒体膜电位大幅下降（图7 d）。据推测，这是因为BRD4在线粒体氧化磷酸化中发挥了关键作用，而内化的12导致膜过度磷酸化，从而导致电位下降。然而，与之形成鲜明对比的是，纯12仅导致很有限的荧光变化，这很可能也是由于12本身的进胞能力较差导致的，这也与免疫荧光实验和后续细胞存活力实验显示的结果一致（图7 e），这些结果清楚地证明了酶模拟、底物选择性催化系统的的高效性和应用潜力。

综上，本文使用简单的聚合-交联方法，制备了粒径、电荷密度和电荷类型可调的DSNP催化剂，并研究了其结构-性能关系，最终选择了 PDSNP S‑2/3作为MEC进行了性质与应用探究。底物选择性探究表明DSNP对阴离子底物具有明显的偏好性，并可通过直接在MEC支架中生成低细胞渗透性分子来促进产物的跨膜运输，这为前药设计、胞内递送等提供了新的策略与方法。

【团队介绍】

湖南大学白玉罡教授课题组（http://www.baigroup.online/）于2017年成立，主要研究方向是生物大分子的设计、制备、性质研究及其在化学生物学和生物医学中的应用。课题组通过合理的设计和可控的化学合成获取具备不同功能结构的生物大分子，利用其作为平台来建立抗菌、催化、递送等方向的应用。该课题组位于湖南大学主校区化学生物学与纳米医学研究所（ICBN），是化学生物传感与计量学国家重点实验室、湖南省生物大分子化学生物学重点实验室的一部分。

https://doi.org/10.1021/jacs.2c11168

来源：高分子科学前沿

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